Lâminas permanentes e a sua preparação

Para observação de tecidos por microscopia óptica, é necessário a lâmina permanente com o tecido preparado.
O procedimento mais usado é a preparação por cortes histológicos, onde os tecidos e órgãos devem ser fatiados em secções ou cortes histológicos muito delgados (finos) por meio de instrumentos de grande precisão chamados micrótomos.

Micrótomo (Imagem retirada da internet)

 Mas, antes de serem fatiados os tecidos e órgãos necessitam sofrer uma série de tratamentos que serão descritos a seguir:

Fixação
Para preservar a estrutura e a composição molecular o material deve ser tratado antes ou mais rapidamente possível para evitar a digestão dos tecidos por enzimas presentes no interior das células (autólise) ou por bactérias.
O tratamento é feito por substâncias químicas ou por métodos físicos (menos frequente).
Fixação química:
 Os tecidos devem estar em fragmentos bem pequenos para facilitar a penetração, estes são imersos em soluções de agentes desnaturantes ou de agentes que estabilizam as moléculas como: solução isotônica tamponada de formaldeído a 4% ou glutaraldeído, esses reagem com o grupo amina (NH2) das proteínas dos tecidos.

Inclusão
Após a fixação, para se obter secções delgadas no micrótomo, o fragmento de tecido e órgãos devem ser infiltrados em substâncias que proporcionem rigidez como: parafina e algumas resinas de plástico.
A inclusão é compreendida por duas etapas:

·         Desidratação: a água é extraída com banhos em soluções com concentrações crescentes de etanol (normalmente de etanol 70% a etanol 100%), após a desidratação o etanol deve ser substituído por uma substância intermediária (geralmente solvente orgânico) que é miscível tanto em etanol como no meio que foi escolhido para inclusão.
Obs: Para inclusão em parafina a substância mais usada é o Xilol

·         Clareamento: os fragmentos de tecido são embebidos e saturados com o solvente orgânico, assim ficando transparentes  

A seguir são colocados em parafina previamente derretida (normalmente 58-60°C), pois o calor causa a evaporação do solvente, que deixa espaços que serão preenchidos pela parafina.
O tecido embebido de parafina, após retirado da estufa torna-se rígidos, prontos para serem levados ao micrótomo e serem seccionados por lâmina de aço ou vidro, fornecendo cortes de 1-10 micrometros de espessura.
Os cortes são colados para flutuar sobre uma superfície de água aquecida, de onde são colados sobre a lâmina, aderindo-se a elas.

Coloração
A maioria dos tecidos é incolor e para que obtenha uma melhor visualização dos cortes histológicos, eles devem ser corados com corantes específicos, que se comportam como compostos ácidos ou básicos que formam ligações com os componentes do tecido.
Corantes ácidos: eosina*, fucsina, etc.
Corantes básicos: hematoxilina*, azul de metileno, etc.

(*combinação mais usada)
Componentes basófilos (só se coram com corantes básicos), pois estes contém ácidos na composição, como: ácidos nucléicos, glicosaminoglicanas, glicoproteínas ácidas.
Componentes acidófilos (só se coram com corantes ácidos), pois estes contém elementos básicos na composição, como: mitocôndrias, colágeno, proteínas citoplasmáticas.